经过两个阶段的超速离心和凝胶过滤后，将外泌体制剂与带有硫酸乙醛基团的乳胶球（Invitrogen，Waltham，MA，USA）一起在室温下孵育30分钟。加入TBS缓冲液（pH 7.5;（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl））至体积为200μL，并将混合物在搅拌下于4°C孵育过夜。接下来，将带有球的混合物与1 M甘氨酸（1：1）在22°C下孵育30分钟，以封闭未结合的乙二醛醛基团，以1600x g离心3分钟，并用200μL的水洗涤沉淀两次0.5％牛血清白蛋白在10％胎牛血清中。然后，将样品与结合有异花青素荧光标记的CD81抗体一起孵育，同时将与CD9的异硫氰酸荧光素荧光标记（Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）结合的抗体在4°C下孵育1 h，以1600×g离心。在22℃下3分钟，除去上清液，将沉淀重悬于200μLTBS中。在所有情况下，第一次超速离心后，最终混合物均对应于相同量的外泌体初始溶液。在没有囊泡的情况下与抗体一起孵育的乳胶球用作阴性对照。使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）分析获得的样品；结果使用FACSDiva版本6.1.3软件（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）进行处理。 4.7 外泌体纳米颗粒的跟踪分析 凝胶过滤后，将胎盘囊泡制剂的等分试样重新悬浮在TBS缓冲液中。通过使用设备Nanosight NS300（英国Malvern）分析其运动轨迹（纳米颗粒跟踪分析），评估了各种大小的囊泡的相对大小和含量。 对于每种准备，均实施了3次连续且每次10 s的调查。数据分析使用Nanosight NTA v3.2（Malvern Instruments，Malvern，英国）。 4.8 SDS-PAGE化验 根据Laemmli的方法，使用含0.1％SDS的4-18％聚丙烯酰胺凝胶对外泌体蛋白质进行电泳分析[38]。在SDS-PAGE之前，将含有20–45μg蛋白质的外泌体制剂在含有50 mM Tris-HCl，pH 6.8、1％SDS，10％甘油，0.025％溴酚蓝，10 mM EDTA（有或没有10 mM）的缓冲液A中预孵育DTT在100℃下10-15分钟，然后涂到凝胶上。在某些情况下，在电泳前，将小泡在含有25 mM混合物的胰蛋白酶（10μM，Promega，Fitchburg，WI，USA）或胰凝乳蛋白酶（5μm，Sigma）的存在下于37°C孵育5分钟。 pH 7.5的Tris-HCl，0.33 mM DTT，0.03 mM EDTA，1.3 mM NaCl，2.5 mM MgCl2。通过添加缓冲液A终止反应，然后通过SDS-PAGE分离蛋白质。在25°C的缓冲液中进行电泳1.5–2小时：25 mM Tris-甘氨酸，pH 8.3，在100–170 V时使用0.1％SDS。蛋白质用考马斯R-250或胶体银染色。 4.9电泳后蛋白质的胰蛋白酶解 蛋白质鉴定使用1D或2D电泳后的胰蛋白酶水解产物的MALDI-TOF MS和MS / MS光谱进行（如[38]中所述）。在2D电泳的情况下，首先使用等电聚焦蛋白质的装置（Protean IEF Cell，Bio-Rad，Hercules，CA，美国）进行蛋白质分离。为了根据蛋白质的等电点分离凝胶中的蛋白质，使用了条带（线性pH 3-10，18 cm，Bio-Rad，美国）。将外泌体保存在补液中（8 M尿素，2％NP-40、0.2％两性电解质（pH 3-10）和50 mM DTT）并转移到聚焦室中，将胶条放在凝胶和矿物上上油。将条带被动补水1 h，然后在50 V上主动补水12 h。在250 V下进行等电聚焦15分钟，然后在10,000 V下进行7 h。等电聚焦后，将条带在含0.38的缓冲液中孵育30分钟M Tris-HCl pH 8.8、6 M尿素，20％甘油，2％SDS和0.001％溴酚蓝。接下来，将试纸条在含有100 mM碘乙酰胺而无DTT的相同缓冲液中温育30分钟。孵育后，将胶条置于凝胶中并进行SDS电泳。蛋白用考马斯R-250染色。 SDS-PAGE化验后，将获得的凝胶用考马斯R-250染色，将其片段用100μLMilliQ水在振荡器上洗涤两次，每次15分钟，然后两次用50μL的含50％乙腈的50 mM NH4HCO3洗涤30分钟。为了除去H2O，将凝胶片段用100μL100％CH3CN洗涤20分钟。然后，使用真空蒸发器将这些凝胶碎片在30℃下干燥10分钟。为了水解蛋白质，将20μL的含12.5μg/ mL胰蛋白酶进行测序的25 mM NH4HCO3（Promega）添加到凝胶片中，并在0°C孵育45分钟后，除去溶液。接下来，将凝胶片段在37°C下于20μL的25 mM NH4HCO3中孵育18 h，然后除去溶液。为了提取肽，将凝胶片段在摇床上用25μL的含50％乙腈的50 mM NH4HCO3洗涤两次，每次15分钟。将经过3次凝胶处理的级分合并，冻干，溶解在10–20μL水中，用于MALDI-TOF质谱分析。 补充材料：以下材料均可在此网站获取http://www.mdpi.com/1422-0067/20/10/2434/s1. 贡献作者: E.E.B. and S.E.S., different experiments; D.V.B. and P.S.D., MALDI mass spectrometry; A.E.G. and E.I.R., electron microscopy; V.V.V. and G.A.N., work organization and article writing. 赞助: This research was maintained by the Russian Science Foundation 18-74-10055. 利益冲突: The author has declared no competing interests. 缩写索引 Ab antibody
Abz abzyme;
