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人类胎盘的超纯外泌体含少量几种的主要蛋白质
来源: | 作者:Evgeniya E. Burkova 1, Alina E. Grigor’eva 1, Dmitrii V. Bulgakov 2, Pavel S. Dmitrenok 3, Valentin V. Vlassov 1, Elena I. Ryabchikova 1 , Sergey E. Sedykh 1,†
and Georgy A. Nevinsky | 发布时间: 2020-06-23 | 11176 次浏览 | 分享到:

4），α-肌动蛋白4（3），碱性磷酸酶（4），HSA（4），血清转铁蛋白（4）和IgG（4）。补充表S1列出了四种外泌体制剂经过电泳分析（1D和2D）后使用MS和MS / MS鉴定所有蛋白质的数据。

       然而，这也不能明确地说所有鉴定出的蛋白质都是外来体的内部蛋白质。由于它们与外泌体表面的有效相互作用，其中一些会共沉淀。图2A证明某些外泌体颗粒看起来与蛋白质及其复合物结合。因此，在SDS-PAGE之前，我们用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理了exo-3制剂。从图6A（泳道3）可以看出，用蛋白酶，HSA和免疫球蛋白以及蛋白质CD81和CD63处理后，几乎消失了。 CD81和CD63的蛋白水解可以很容易地通过以下事实来解释：这些蛋白质存在于外泌体的表面，因此蛋白酶很容易获得。 HSA和免疫球蛋白似乎只是与外泌体共沉淀，或者它们以某种方式与外泌体表面或外泌体膜蛋白密切相关。

       图6. exo-3制剂的蛋白质在其过滤之前（泳道1）和用二硫苏糖醇处理（泳道2）以及经过胰蛋白酶  处理后（泳道3）（A）的凝胶进行SDS-PAGE分析。分子量标记（泳道C）。DTT处理后，HSA的分子         量由于二硫键的减少而增加（泳道2），而IgG对应的条带由于形成了游离的重链和轻链而消失。用      胰蛋白酶处理可导致HSA，IgG，  CD63和CD81水解，但不会水解该制剂的其他蛋白质（泳道3，        A）。通过凝胶过滤分离exo-3蛋白的二维凝胶电泳（B）。首先使用等电聚焦分离蛋白质，然后通 过SDS-PAGE分离蛋白质。用考马斯R-250染色的28个蛋白斑点对应于：血红蛋白亚基（斑点1），膜  联蛋白A2（2、3、4和28），膜联蛋白A5（5、6和7），膜联蛋白A1（8） ，免疫球蛋白的胞质肌动    蛋白（9、10、11、12、13、14和15），轻链（16）和重链（17和18），碱性磷酸酶（19、20、  21、22和23）， HSA（24和25）和血清转铁蛋白（26，27）。

         表2.通过MS和MS / MS方法鉴定的蛋白质的数据，这些蛋白质对应于exo-3（图1C）和exo-3（图     6B）凝胶过滤后的第一个峰，以及随后通过2D电泳分离的峰。


3.讨论

       首先，从四个胎盘获得粗囊泡制剂（区别在使用的不同的离心作用）。它们并不纯净含有杂质，并包含许多大小约30-300 nm的不同囊泡的结构，各种蛋白质及其大分子（图2）。通过过滤器（100 nm）过滤这些制剂，并通过凝胶过滤进行纯化，可去除某些类型的囊泡以及许多共沉淀的蛋白质及其复合物（图1和图3）。通过凝胶过滤分离的外泌体含有CD81和CD63（图3）。因此，从人胎盘中分离出来的囊泡在形态，大小（30-100 nm）以及其表面CD81和CD63四跨膜蛋白的含量方面相当于先前从各种来源获得的囊泡[5]。

       根据文献，来自各种生物体液和组织的外泌体可能包含数十种至数千种不同的蛋白质。但是，大多数使用各种离心方法获得的外泌体制剂的研究[1,5–27]包含大量非常不同的杂质，包括不同的囊泡，无膜的结构（“非囊泡”），蛋白质及其相关物（图2）。）。此类制剂的凝胶过滤导致主要杂质的分离。通过凝胶过滤分离的胎盘外泌体的MALDI质谱分析仅鉴定出几种主要蛋白质。但是，在凝胶过滤后的第二个和第三个峰中检测到了大量不同的蛋白质（图1）。

       使用二维电泳后，发现了28个蛋白质斑点对应9种不同的蛋白质及其同工型（表2）。总体而言，使用两种电泳分析方法，在四种外泌体制剂中鉴定出12种蛋白质：CD81，CD63，血红蛋白亚基，膜联蛋白A1，膜联蛋白A2，膜联蛋白A5，胞质肌动蛋白，α-肌动蛋白-4，碱性磷酸酶，血清转铁蛋白，HSA，免疫球蛋白（表1和2）。此外，使用流式细胞仪显示了CD9（图4）。

       铁蛋白在使用凝胶过滤和蛋白水解酶处理外泌体后消失。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理外泌体制剂后，据SDS-PAGE数据显示，对应于HSA和免疫球蛋白的蛋白条带几乎完全消失。不能排除HSA和免疫球蛋白能与四跨膜蛋白形成相对稳定的复合物，或直接与外泌体表面相互作用。

       随之而来的问题是为什么我们检测到的蛋白质比其他研究人员发现的要少得多[33,34]。 图1显示，与对应共沉淀蛋白的第二个和第三个凝胶过滤峰相比，外泌体峰在280 nm处吸收峰值相小于7％。 图2A显示，纯化不良的制剂不仅包含各种大小的囊泡，而且还包含许多蛋白质及其复合物。 先前发表的文章描述了从胎盘滋养层细胞获得的外泌体[34,35]。 因此，不能排除在正常妊娠期间胎盘细胞和培养的细胞可以分泌含有不同蛋白质组的外泌体。

       从我们的分析来看，从各种来源分离出来的外泌体中直接包含的实际蛋白质数量（数十万种）可能会被过度高估。

       根据文献数据所提供的，胎盘外泌体可能含有数十至数千种不同的蛋白质[30,31]。例如，在胎盘外泌体CD9、CD63、CD81 [30,31]、胎盘碱性磷酸酶[10]、促凋亡FasL1-4和TRAIL [9]的许多蛋白质中，发现了调节性细胞因子TGFb [10]、合体素1和syncytin-2蛋白[42] 。然而在在雌性胎盘的外泌体制剂中，我们仅发现其中一些蛋白质：CD9，CD81，CD-63和碱性磷酸酶。由于在发表的论文[9,10,30,31,42]中仅通过各种类型的离心分离了外泌体，我们的数据无法与它们进行比较，还有一个悬而未决的问题：被发现的蛋白哪些是直接属于外泌体的？在这方面，我们应注意以下数据。通过三种不同方法（超速离心，高分辨率密度梯度分级分离和直接免疫亲和捕获）的顺序组合，从人结肠癌DKO-1中获得了高度纯化的外泌体制剂[43]。结果表明，这些外泌体制剂仅包含