15种主要蛋白质：CD9，CD63，CD81，膜联蛋白A2，膜联蛋白V，TSG101，Syntenin 1，ALIX，14-3-3 zeta /δ，14-3-3 epsilon，HSC70， EEF1-A1，醛缩酶A，烯醇酶I和LADH。我们在胎盘外泌体中发现了这些蛋白质中的六个：CD9，CD81，CD-63，膜联蛋白A2，膜联蛋白A5。但是，来自不同器官和细胞的外泌体制剂中不同蛋白质的含量很可能差异很大。例如，来自几种不同马奶的超纯外泌体仅包含五个相同的主要蛋白质（CD9，CD81，CD63，β-乳球蛋白和乳黏附素），而肌动蛋白，酪氨酸，乳铁蛋白和黄嘌呤脱氢酶仅在某些他们[40]。在来自各种器官和细胞的外泌体的情况下，蛋白质组成的更大差异。

       尽管现在还未发现我们在外泌体中鉴定出的主要蛋白的重大意义和功能，所有这些蛋白质在哺乳动物的机体中都起着重要的作用[44-48]。例如，膜联蛋白已显示出直接参与囊泡的形成以及胞吐和胞吞过程中囊泡的运输。

       在本项研究中，我们分析了来自人胎盘的额外纯化外泌体的主要蛋白质发现它们包含相对少量的主要蛋白质。当然这些外泌体也可能包含一些其他微量蛋白质，是无法使用SDS-PAGE和MALDI质谱检测到的。但从我们的实验结果出发，从外泌体中鉴定出成百上千种蛋白质的结论是被过度高估了。另外，在外泌体中发现的蛋白质的多样性提出了与这些囊泡共沉淀的蛋白质以及外泌体的可能固有的次要蛋白质在外泌体的生物学功能中是否具有重要作用的疑问。

4.材料和方法 

4.1材料 

       Sepharose 4B的试剂和吸附剂来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。 根据赫尔辛基伦理委员会的指导，采血方案符合当地人类伦理委员会的指导原则（2015年1月20日由俄罗斯新西伯利亚的新西伯利亚国立医科大学伦理委员会批准；机构伦理委员会专门批准了本研究）。 为了科学目的，所有母亲均签署提供胎盘的书面授权书。 产科医生/妇科医生为我们提供了来自正常妊娠母亲（20-32岁）的匿名胎盘样本，这些母亲没有自身免疫，风湿病，呼吸道，心血管，胃肠道，生殖或神经系统疾病的病史。 提供授权书和样本的女性均生育了健康的孩子。

4.2 胎盘提取物的制备

       为防止血液凝结，每个新鲜的胎盘样本都被放置于2.0 L 1％柠檬酸钠溶液中。为清楚胎盘余血，使用几个注射器（40 mL），将与0.1％NaCl对应的1％柠檬酸钠溶液在压力下注入胎盘的血管，该注射器分别对应于所有大，中，小血管以及不同厚度的针头。然后，将新鲜的胎盘（〜400–500 g）切成小块，用缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，125 mM KCl，0.5 mM EDTA-NaOH，pH 7.5和0.5％钠）洗涤3次。柠檬酸盐）以清除残留的血液。接下来，将胎盘的压碎片在含有250 mM蔗糖，20 mM Tris-HCl（pH 7.5），125 mM KCl，10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA（pH）的冷缓冲液（+4°C; 425 mL）中匀浆7,5）和0.5％的柠檬酸钠。胎盘匀浆以26,000x g离心30分钟（Beckman Coulter Avanti-J-301离心机，JA-30.50Ti转子，Brea，CA，美国），除去沉淀物。将上清液用H2O透析2 h，然后用TBS缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl）透析12 h，然后将透析的上清液用于分离外泌体。      

4.3 囊泡制剂的纯化和制签

       胎盘提取物制剂从总胎盘中获得。 将上清液进行顺序离心：在10,000×g下于4℃离心40分钟，然后在16,500×g上离心20分钟（Beckman Coulter Avanti-J-301离心机，JA-30.50 Ti转子），将上清液通过0.22微米过滤器。 将过滤的上清液以100,000×g超速离心2小时。 第一次离心后，将沉淀重悬于8 mL TBS中。 将重悬的沉淀物以100,000×g超速离心2小时（Beckman L8-M离心机，SW-60转子（Brea，CA，美国）），将沉淀重悬，通过过滤器（0.1μm）过滤并用于进一步纯化 为了进一步纯化外泌体，使用琼脂糖凝胶4B在柱上进行凝胶过滤。 

4.4 凝胶过滤纯化囊泡制剂 

       为了进一步纯化外泌体，如[38]所述，使用分子量为60–20,000 kDa的Sepharose 4B分离蛋白进行凝胶过滤。将浓缩的外泌体溶液（0.5 mL）用GE Akta Purifier色谱仪（Chicago，IL. USA）和同一缓冲液洗脱的馏分（1 mL）。 通过在280nm处的吸光度监测外泌体和蛋白质。 为了除去NaCl，将级分在4°C下用20 mM Tris-HCl（pH 7.5）透析14 h，然后用于不同类型的分析。所有实验均在无菌条件下进行。 

4.5 外泌体的电子显微镜研究      

       将涂有聚醋酸甲基乙烯脂的铜栅格放在一滴外泌体制剂上1分钟，然后用滤纸收集多余的液体，然后将栅格与0.5％的乙酸铀酰溶液或2％的磷钨酸溶液对比。如[38]中所述，酸持续10-15 s。使用配备有Veleta数码相机（EM SIS，德国明斯特）的Jem1400（日本东京，Jeol）透射电子显微镜检查网格。为了鉴定外泌体的特异性标记，将囊泡与抗CD81和CD63的小鼠单克隆抗体在室温下于振荡器上孵育18小时；然后，它们被吸附到网格上。接下来，用PBS（10 mM Na2HPO4、1.76 mM KH2PO4（pH 7.4），137 mM NaCl和2.7 mM KCl）洗涤网格，并与与10–12 nm金纳米颗粒偶联的蛋白A于室温下在潮湿的房间孵育2小时。然后，用PBS洗涤网格以去除未结合的抗体，并用2％的磷钨酸溶液进行负染色10-15 s。在Jem1400电子显微镜中研究样品。 

4.6 外泌体的流式细胞