肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
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作者:詹妮弗·M·贝茨1，Janie Akerlund，Erika Mittge，和Karen Guillemin
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发布时间: 2020-06-23
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脊椎动物的肠道菌群中含有丰富的脂多糖（LPS）或内毒素。我们证明，刷状缘酶-肠碱性磷酸酶（Iap）在斑马鱼肠道菌群形成过程中被诱导从而在促进黏膜对肠道细菌的耐受中起着关键作用。我们证明，iap缺乏的动物对lps的毒性反应是通过Myd88和肿瘤坏死因子受体（Tnfr）介导的机制来感应的。我们进一步证明，内源性微生物群通过一个涉及myd88和tnfr的过程建立了肠道中性粒细胞的正常稳态水平。iap缺乏的动物表现出过多的肠道中性粒细胞流入，类似暴露于lps的野生型动物。但在无细菌饲养的情况下，缺乏Iap的动物的肠道内缺乏中性粒细胞，这表明iap具有防止肠道细菌炎症反应的功能。
1神经科学研究所，俄勒冈大学，尤金，OR 97403，美国
2俄勒冈大学分子生物学研究所，尤金, OR 97403，美国
纲要
脊椎动物的肠道菌群中含有丰富的脂多糖（LPS）或内毒素。我们证明，刷状缘酶-肠碱性磷酸酶（Iap）在斑马鱼肠道菌群形成过程中被诱导从而在促进黏膜对肠道细菌的耐受中起着关键作用。我们证明，iap缺乏的动物对lps的毒性反应是通过Myd88和肿瘤坏死因子受体（Tnfr）介导的机制来感应的。我们进一步证明，内源性微生物群通过一个涉及myd88和tnfr的过程建立了肠道中性粒细胞的正常稳态水平。iap缺乏的动物表现出过多的肠道中性粒细胞流入，类似暴露于lps的野生型动物。但在无细菌饲养的情况下，缺乏Iap的动物的肠道内缺乏中性粒细胞，这表明iap具有防止肠道细菌炎症反应的功能。
介绍
lps是所有革兰氏阴性细菌（包括病原体和共生菌）外膜的主要成分，作为一种细菌相关物质被单独发现，称为内毒素，可引起动物感染性休克(Beutler and Rietschel, 2003) 。我们现在知道lps通过过度刺激toll样受体（toll-like receptor，tlr）固有免疫信号发挥毒素作用，从而诱导致病性炎症反应。缺乏内毒素特异性TLR4或TLRs下游常见适配器MYD88的小鼠对内毒素毒性的抵抗力增强(Kawai et al., 1999; Poltorak et al.,1998) 。TLR信号通过myd88促进nf-κb的核移位和肿瘤坏死因子（tnf）等促炎细胞因子的转录。TNF是脓毒性休克的重要介质，在用TNF阻断抗体治疗的小鼠中观察到的内毒素抵抗证明了这一点（Beutler et al., 1985）。TNF也并不是LPS毒性的唯一介质，事实表明，缺乏TNFα的小鼠（Pasparakis等人，1996年）、其主要受体TNFRP55（Pfeffer等人，1993年）或其75和55 kD受体（Rothe等人，1993年）与野生型小鼠一样，对高剂量的LPS腹腔注射敏感。h它们对低剂量的脂多糖和肝细胞毒素dgalactosamine有更强的抵抗力。TNF和其他促炎性细胞因子诱导血管通透性，血流和中性粒细胞募集进入LPS来源，以及全身反应，例如发烧，在感染性休克的极端情况下，弥散性血管内凝血，低血压甚至最终导致器官功能障碍。
脊椎动物体内lps最丰富的来源之一是肠道菌群。自从发现识别病原体和宿主有益微生物分子特征的先天免疫信号途径以来，一个尚未解决的问题就是为什么肠道微生物群落不会在宿主体内引发病理性炎症。事实上，对微生物群的不当炎症反应在炎症性肠病患者中表现出来（Sartor，2006）。在健康个体中，提倡的保护机制包括从肠上皮分离iga涂层的肠道微生物（macpherson等人，2005年）、肠上皮的屏障功能和肠上皮细胞中固有免疫受体的限制性表达（cario和podolsky，2005年）。
除了通过隔离促炎配体及其受体来限制先天免疫信号外，宿主细胞还可以通过改变促炎微生物分子本身来主动调节炎症反应。这种机制已在一种酰基氧基水解酶的情况下被证明，该酶从脂类lps的一部分裂解酰基链（feulner等人，2004）。在缺乏这种酶的小鼠中，酰化脂多糖在感染革兰氏阴性病原体后持续较长时间，并导致B细胞增殖和抗体产生增加（Lu等人，2005）。碱性磷酸酶（AP）也被证明通过使脂类A部分去磷酸化来修饰脂多糖（Beumer等人，2003；Koyama等人，2002；Tuin等人，2006；Van Veen等人，2005）。脂类A是脂多糖的毒性成分，它含有两个与葡萄糖胺结合的磷酸基团；除去其中一个磷酸基团可生成一个磷酰脂类A，其毒性比未经修饰的脂类A低100倍（Schromm等人，1998）。
在脊椎动物中，aps广泛分布于不同的器官，但其生理基础在很大程度上未知。缺乏普遍表达的组织非特异性AP（TNAP）的小鼠因磷酸吡哆醛代谢缺陷而死于癫痫发作（Waymire等人，1995），论称维生素B-6是小鼠TNAP的天然底物。肠道特异性同工酶（iap）一直是肠上皮细胞成熟的标志物，但其在肠内的生理功能尚不清楚。蛋白质定位于顶端刷缘，富含表面活性剂样颗粒，分泌到肠腔（Alpers等人，1995）。这种酶的活性急剧增加发生在哺乳动物和鱼类胚胎后发育期间，即肠道微生物群建立的时期（Bates等人，2006年；Henning，1985年；Zambonino Infante和Cahu，2001年）。IAP被认为在酪蛋白的消化和吸收中起作用（Li Chan和Nakai，1989）。然而，缺乏iap的小鼠没有明显的消化缺陷，并且实际上表现出脂肪滴通过肠壁的加速运输，当喂食高脂肪饮食时会导致肥胖（nakano等人，2007；narisawa等人，2003）。
我们假设Iap作用于与肠道细菌相关的去磷酸脂多糖，从而调节肠道炎症反应，以应对常驻微生物群。我们用斑马鱼模型测试了这个想法，因为可以比较容易的使用无菌生物学操作和控制细菌关联，利用吗啉反义寡核苷酸（mos）来操纵宿主基因表达。硬骨鱼类和哺乳动物消化道的发育和生理学非常相似（Wallace等人，2005年），两者都对其常驻微生物群有保守的反应（Cheesman和Guillemin，2007年）。我们实验显示斑马鱼像哺乳动物一样，通过涉及Myd88和Tnfr的机制对LPS做出反应。我们报道定居后，肠道微生物通过与外源性LPS相似的机制引起低水平的肠道炎症。最后，我们证明了Iap功能对于解脂LPS和防止肠道炎症反应是必需的。
斑马鱼肠道内碱性磷酸酶基因的鉴定
在先前的工作中，我们显示了在受精后（dpf）5至8天之间，该器官被微生物定殖的期间斑马鱼肠中的刷状缘AP活性增加，但在饲养GF的动物中却没有增加（Bates等，2006）。我们发现，通过用常规饲养（CV）对照中的菌群接种5 dpf GF斑马鱼，我们可以将正常Iap水平恢复8 dpf。此外，我们证明lps暴露足以诱导GF动物中Iap的活性。为了研究LPS调节Iap的机制和功能意义，我们试图鉴定斑马鱼的Iap基因。人类的AP由四个基因座编码：1号染色体上的TNAP和组织特异性同功酶IAP，胎盘AP和生殖细胞AP，它们聚集在染色体2q37的位置，似乎是由串联重复产生的（Millán，2006）。为了分离斑马鱼中的iap基因，我们将编码IAP的鼠Akp3序列（登录号：M61705.1）与斑马鱼基因组进行了比较，该基因组产生了两个碱性磷酸酶基因，分别位于11和22号染色体。与人类相似，这些ap基因是高度相关，但其表达方式而有所不同（Le Du和Millan，2002）。与注释为碱性磷酸酶（alp）的11号染色体ap转录本（登录号：NM_201007）的原位杂交在5 dpf处表现出低水平的普遍表达（数据未显示）。 相比之下，与鼠Akp3共享75％序列同一性的无注释染色体22 ap基因（登录号：NM_001014353）在5 dpf幼虫的肠上皮中特异性表达（图1A，B）。 对来自8 dpf幼虫的解剖肠进行RT-PCR分析，显示了肠22号ap基因的特异性表达，而11号ap染色体的转录在肠中以及在被我们去除肠的样本中的含量都很低（图 1C）。
2俄勒冈大学分子生物学研究所，尤金, OR 97403，美国
纲要
脊椎动物的肠道菌群中含有丰富的脂多糖（LPS）或内毒素。我们证明，刷状缘酶-肠碱性磷酸酶（Iap）在斑马鱼肠道菌群形成过程中被诱导从而在促进黏膜对肠道细菌的耐受中起着关键作用。我们证明，iap缺乏的动物对lps的毒性反应是通过Myd88和肿瘤坏死因子受体（Tnfr）介导的机制来感应的。我们进一步证明，内源性微生物群通过一个涉及myd88和tnfr的过程建立了肠道中性粒细胞的正常稳态水平。iap缺乏的动物表现出过多的肠道中性粒细胞流入，类似暴露于lps的野生型动物。但在无细菌饲养的情况下，缺乏Iap的动物的肠道内缺乏中性粒细胞，这表明iap具有防止肠道细菌炎症反应的功能。
介绍
lps是所有革兰氏阴性细菌（包括病原体和共生菌）外膜的主要成分，作为一种细菌相关物质被单独发现，称为内毒素，可引起动物感染性休克(Beutler and Rietschel, 2003) 。我们现在知道lps通过过度刺激toll样受体（toll-like receptor，tlr）固有免疫信号发挥毒素作用，从而诱导致病性炎症反应。缺乏内毒素特异性TLR4或TLRs下游常见适配器MYD88的小鼠对内毒素毒性的抵抗力增强(Kawai et al., 1999; Poltorak et al.,1998) 。TLR信号通过myd88促进nf-κb的核移位和肿瘤坏死因子（tnf）等促炎细胞因子的转录。TNF是脓毒性休克的重要介质，在用TNF阻断抗体治疗的小鼠中观察到的内毒素抵抗证明了这一点（Beutler et al., 1985）。TNF也并不是LPS毒性的唯一介质，事实表明，缺乏TNFα的小鼠（Pasparakis等人，1996年）、其主要受体TNFRP55（Pfeffer等人，1993年）或其75和55 kD受体（Rothe等人，1993年）与野生型小鼠一样，对高剂量的LPS腹腔注射敏感。h它们对低剂量的脂多糖和肝细胞毒素dgalactosamine有更强的抵抗力。TNF和其他促炎性细胞因子诱导血管通透性，血流和中性粒细胞募集进入LPS来源，以及全身反应，例如发烧，在感染性休克的极端情况下，弥散性血管内凝血，低血压甚至最终导致器官功能障碍。
脊椎动物体内lps最丰富的来源之一是肠道菌群。自从发现识别病原体和宿主有益微生物分子特征的先天免疫信号途径以来，一个尚未解决的问题就是为什么肠道微生物群落不会在宿主体内引发病理性炎症。事实上，对微生物群的不当炎症反应在炎症性肠病患者中表现出来（Sartor，2006）。在健康个体中，提倡的保护机制包括从肠上皮分离iga涂层的肠道微生物（macpherson等人，2005年）、肠上皮的屏障功能和肠上皮细胞中固有免疫受体的限制性表达（cario和podolsky，2005年）。
除了通过隔离促炎配体及其受体来限制先天免疫信号外，宿主细胞还可以通过改变促炎微生物分子本身来主动调节炎症反应。这种机制已在一种酰基氧基水解酶的情况下被证明，该酶从脂类lps的一部分裂解酰基链（feulner等人，2004）。在缺乏这种酶的小鼠中，酰化脂多糖在感染革兰氏阴性病原体后持续较长时间，并导致B细胞增殖和抗体产生增加（Lu等人，2005）。碱性磷酸酶（AP）也被证明通过使脂类A部分去磷酸化来修饰脂多糖（Beumer等人，2003；Koyama等人，2002；Tuin等人，2006；Van Veen等人，2005）。脂类A是脂多糖的毒性成分，它含有两个与葡萄糖胺结合的磷酸基团；除去其中一个磷酸基团可生成一个磷酰脂类A，其毒性比未经修饰的脂类A低100倍（Schromm等人，1998）。
在脊椎动物中，aps广泛分布于不同的器官，但其生理基础在很大程度上未知。缺乏普遍表达的组织非特异性AP（TNAP）的小鼠因磷酸吡哆醛代谢缺陷而死于癫痫发作（Waymire等人，1995），论称维生素B-6是小鼠TNAP的天然底物。肠道特异性同工酶（iap）一直是肠上皮细胞成熟的标志物，但其在肠内的生理功能尚不清楚。蛋白质定位于顶端刷缘，富含表面活性剂样颗粒，分泌到肠腔（Alpers等人，1995）。这种酶的活性急剧增加发生在哺乳动物和鱼类胚胎后发育期间，即肠道微生物群建立的时期（Bates等人，2006年；Henning，1985年；Zambonino Infante和Cahu，2001年）。IAP被认为在酪蛋白的消化和吸收中起作用（Li Chan和Nakai，1989）。然而，缺乏iap的小鼠没有明显的消化缺陷，并且实际上表现出脂肪滴通过肠壁的加速运输，当喂食高脂肪饮食时会导致肥胖（nakano等人，2007；narisawa等人，2003）。
我们假设Iap作用于与肠道细菌相关的去磷酸脂多糖，从而调节肠道炎症反应，以应对常驻微生物群。我们用斑马鱼模型测试了这个想法，因为可以比较容易的使用无菌生物学操作和控制细菌关联，利用吗啉反义寡核苷酸（mos）来操纵宿主基因表达。硬骨鱼类和哺乳动物消化道的发育和生理学非常相似（Wallace等人，2005年），两者都对其常驻微生物群有保守的反应（Cheesman和Guillemin，2007年）。我们实验显示斑马鱼像哺乳动物一样，通过涉及Myd88和Tnfr的机制对LPS做出反应。我们报道定居后，肠道微生物通过与外源性LPS相似的机制引起低水平的肠道炎症。最后，我们证明了Iap功能对于解脂LPS和防止肠道炎症反应是必需的。
斑马鱼肠道内碱性磷酸酶基因的鉴定
在先前的工作中，我们显示了在受精后（dpf）5至8天之间，该器官被微生物定殖的期间斑马鱼肠中的刷状缘AP活性增加，但在饲养GF的动物中却没有增加（Bates等，2006）。我们发现，通过用常规饲养（CV）对照中的菌群接种5 dpf GF斑马鱼，我们可以将正常Iap水平恢复8 dpf。此外，我们证明lps暴露足以诱导GF动物中Iap的活性。为了研究LPS调节Iap的机制和功能意义，我们试图鉴定斑马鱼的Iap基因。人类的AP由四个基因座编码：1号染色体上的TNAP和组织特异性同功酶IAP，胎盘AP和生殖细胞AP，它们聚集在染色体2q37的位置，似乎是由串联重复产生的（Millán，2006）。为了分离斑马鱼中的iap基因，我们将编码IAP的鼠Akp3序列（登录号：M61705.1）与斑马鱼基因组进行了比较，该基因组产生了两个碱性磷酸酶基因，分别位于11和22号染色体。与人类相似，这些ap基因是高度相关，但其表达方式而有所不同（Le Du和Millan，2002）。与注释为碱性磷酸酶（alp）的11号染色体ap转录本（登录号：NM_201007）的原位杂交在5 dpf处表现出低水平的普遍表达（数据未显示）。 相比之下，与鼠Akp3共享75％序列同一性的无注释染色体22 ap基因（登录号：NM_001014353）在5 dpf幼虫的肠上皮中特异性表达（图1A，B）。 对来自8 dpf幼虫的解剖肠进行RT-PCR分析，显示了肠22号ap基因的特异性表达，而11号ap染色体的转录在肠中以及在被我们去除肠的样本中的含量都很低（图 1C）。
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