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肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
来源: | 作者:詹妮弗·M·贝茨1，Janie Akerlund，Erika Mittge，和Karen Guillemin | 发布时间: 2020-06-23 | 11211 次浏览 | 分享到:

       碱性磷酸酶-AP活性如前所述被量化（Bates等人，2006）。简单地说，从10个幼虫或从中取出肠子的尸体上分离出的肠子被汇集、称重、均质并在对硝基苯基磷酸酯液体基质系统（sigma）中培养30分钟，在405nm处测量吸光度。
吗啉注射液
       剪接阻断吗啉（mos）是从基因工具（corvalis，or）中获得的，除了myd88e2i2，这是lalita ramakrishnan博士（华盛顿大学）慷慨的礼物。所有的MOs 在一个细胞期以指定的最终量注入胚胎：IAPe2i2 (3 pmoles), TRlv1/TRlv2 (1.2 pmoles and 6 pmoles, respectively), MyD88e2i2 (25 pmoles), galTe2i2 (5.9 pmoles). MO oligo sequences are as follows: IAPe2i2: 5′-TGTAAAGTCGTCTTCATCACTCACC-3′, MyD88 e2i2: 5′- GTTAAACACTGACCCTGTGGATCAT-3′,TRlv1:5′- TACGTCCTTGTGCATTGCTGGCATC-3′,TRlv2:5′- CTGCATTGTGACTTACTTATCGCAC-3′.galTe2i2:5′ AAATCATTATGCACTCACCTGATGG-3′.
       通过RT-PCR分析来自注入的幼虫的cDNA，使用设计成跨剪接位点的特异性引物观察到剪接阻断。 引物序列如下：IAPe1F: 5′-TCAGAGGCTCGGGATGTGTTTG-3′, IAPe5R:5′-GACTTTCCTTGTGCTTTGGCG-3′;MyD88elF:5′- TCTTGACGGACTGGGAAACTCG-3′,MyD88e5R:5′- GATTTGTAGACGACAGGGATTAGCC-3′;TR1F:5′- GCATGGATCCATATCAGGACTTGGTGGA-3′,TR1R:5′。 myd88-MO显示接近完全的剪接阻断，而tnfr1-MO和iap-MO在8 dpf时部分阻断了目标转录物的剪接（图S1）TCGAGAATTCTTACGAAACGCTTGTGTT-3′.
半定量RT-PCR分析
       收集20只对照动物或用150μg/ ml LPS处理2小时的20只动物的解剖肠或剩余动物尸体，并通过匀浆并用Trizol试剂（Invitrogen）提取来收集RNA。 使用不含Turbo DNA的试剂盒（Ambion）进一步纯化RNA，以污染基因组DNA。 按照制造商的说明，将RNA用作模板，用Superscript III逆转录酶和随机引物（Invitrogen）生成cDNA。 随后通过PCR进行cDNA扩增25个循环，每个循环包括在94°变性15s，在59°退火30s引物和在72°延伸1分钟。 使用Taq DNA聚合酶（Roche）和20 pmol基因特异性引物对200ng cDNA进行测定。引物序列如下：IAPF: 5′-ATGGGAGTGTCCACGGTTTCAG-3′IAPR:5′-CGATGCCAACAGACTTTCCTTG-3′,ALPF:5′-GAAGGTCGTACAACTGCTTATCC-3′,ALPR:5′-
GATTCCCACTGATTTGCCTGC-3′,EF1AF:5′-CGTCTGCCACTTCAGCATGTG-3′,EF1AR:5′ACTTGCAGGCGATGTGAGCAG-3′.
Assays were performed using a TProfessional thermocycler (Biometra).
SYBR-Green实时定量（q）RT-PCR分析
       从8dpf的GF，CV或MO注射的幼虫中收获RNA，并如上所述产生cDNA。 在25μl反应中用对应于600 ng总RNA的cDNA和300nM基因特异性或对照引物进行qRT-PCR分析。 使用Primer Express 2.0软件（Applied Biosystems）设计基因特异性引物。Primer sequences are as follows; IAP151: 5′-GCCCTCACACTGCCTCTCA-3′, IAP233: 5′GAAACCGTGGACACTCCCATT-3′, TNF1F: 5′-TCCTCAGACCACGGAAAAGTG-3′,
TNF1R: 5′-CAACCCATTTCAGCGATTGTC-3′, TNF2F: 5′-
GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3′, TNF2R: 5′-
TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3′, EF1AF: 5′-
CGTCTGCCACTTCAGCATGTG-3′, EF1AR: 5′-ACTTGCAGGCGATGTGAGCAG-3′.
使用ABI Prism 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）一式三份进行测定。 将数据标准化至EF1A (ΔΔ Ct analysis, as described in the ABI User Bulletin #2, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).
组织学
       除非另有说明，否则将斑马鱼幼虫在4％多聚甲醛中固定过夜，包埋在石蜡中，然后切成7μm厚的切片并将其安装在载玻片上。 样品在带有Nomarski和荧光光学镜的尼康TE2000倒置显微镜上成像。 使用CoolSNAP相机（Photometrics）或QImage Micropublisher相机（QImaging Corp）获得数字图像。 使用Metamorph收集并分析图像，并在Adobe Photoshop中进行处理。 对苏木精和曙红（H＆E）染色的7μm横切面进行了与LPS治疗相关的组织病理学分析。
       原位杂交--将5 dpf幼虫在4％PFA中静置过夜，并在1XPBST中洗涤。 将整个山体幼虫平衡到HYB +缓冲液中（Westerfield，1993），并在65°C下预杂交4h。 根据Boehringer的说明书（目录号1175025）制备RNA探针，并将HYB +中的100 ng RNA探针在65°C加热60分钟。 幼虫与RNA探针杂交36h。 通过将幼虫在2XSSC中的70％的50％甲酰胺中浸泡30分钟，然后在70°C的2XSSC的溶液中漂洗30分钟，并在70°C的0.2XSSC的溶液中漂洗2次，以除去探针。 根据标准方案（Westerfield，1993）检测探针，并如前所述将幼虫切成薄片进行成像。
       髓过氧化物酶--将幼虫在4％PFA中静置过夜，并在1XPBS中洗涤。 用髓过氧化物酶试剂盒（Sigma）对整个幼虫进行染色，以对中性粒细胞进行组织化学鉴定。 Mpo活性已被用作斑马鱼嗜中性粒细胞的标志物，尽管在嗜酸性粒细胞和红细胞中也观察到弱染色（Lieschke等，2001），因此要注意不要过度显影Mpo染色。 染色后，将幼虫用0.1％Tween的1XPBS洗涤，包埋在石蜡中，将7μm的横切面固定在载玻片上。 定量分析肠上皮中Mpo染色强的细胞，该区域位于距肛门140微米的肛门连续20个连续切片中。