肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
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作者:詹妮弗·M·贝茨1,Janie Akerlund,Erika Mittge,和Karen Guillemin
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发布时间: 2020-06-23
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脊椎动物的肠道菌群中含有丰富的脂多糖(LPS)或内毒素。我们证明,刷状缘酶-肠碱性磷酸酶(Iap)在斑马鱼肠道菌群形成过程中被诱导从而在促进黏膜对肠道细菌的耐受中起着关键作用。我们证明,iap缺乏的动物对lps的毒性反应是通过Myd88和肿瘤坏死因子受体(Tnfr)介导的机制来感应的。我们进一步证明,内源性微生物群通过一个涉及myd88和tnfr的过程建立了肠道中性粒细胞的正常稳态水平。iap缺乏的动物表现出过多的肠道中性粒细胞流入,类似暴露于lps的野生型动物。但在无细菌饲养的情况下,缺乏Iap的动物的肠道内缺乏中性粒细胞,这表明iap具有防止肠道细菌炎症反应的功能。
碱性磷酸酶-AP活性如前所述被量化(Bates等人,2006)。简单地说,从10个幼虫或从中取出肠子的尸体上分离出的肠子被汇集、称重、均质并在对硝基苯基磷酸酯液体基质系统(sigma)中培养30分钟,在405nm处测量吸光度。
吗啉注射液
剪接阻断吗啉(mos)是从基因工具(corvalis,or)中获得的,除了myd88e2i2,这是lalita ramakrishnan博士(华盛顿大学)慷慨的礼物。所有的MOs 在一个细胞期以指定的最终量注入胚胎:IAPe2i2 (3 pmoles), TRlv1/TRlv2 (1.2 pmoles and 6 pmoles, respectively), MyD88e2i2 (25 pmoles), galTe2i2 (5.9 pmoles). MO oligo sequences are as follows: IAPe2i2: 5′-TGTAAAGTCGTCTTCATCACTCACC-3′, MyD88 e2i2: 5′- GTTAAACACTGACCCTGTGGATCAT-3′,TRlv1:5′- TACGTCCTTGTGCATTGCTGGCATC-3′,TRlv2:5′- CTGCATTGTGACTTACTTATCGCAC-3′.galTe2i2:5′ AAATCATTATGCACTCACCTGATGG-3′.
通过RT-PCR分析来自注入的幼虫的cDNA,使用设计成跨剪接位点的特异性引物观察到剪接阻断。 引物序列如下:IAPe1F: 5′-TCAGAGGCTCGGGATGTGTTTG-3′, IAPe5R:5′-GACTTTCCTTGTGCTTTGGCG-3′;MyD88elF:5′- TCTTGACGGACTGGGAAACTCG-3′,MyD88e5R:5′- GATTTGTAGACGACAGGGATTAGCC-3′;TR1F:5′- GCATGGATCCATATCAGGACTTGGTGGA-3′,TR1R:5′。 myd88-MO显示接近完全的剪接阻断,而tnfr1-MO和iap-MO在8 dpf时部分阻断了目标转录物的剪接(图S1)TCGAGAATTCTTACGAAACGCTTGTGTT-3′.
半定量RT-PCR分析
收集20只对照动物或用150μg/ ml LPS处理2小时的20只动物的解剖肠或剩余动物尸体,并通过匀浆并用Trizol试剂(Invitrogen)提取来收集RNA。 使用不含Turbo DNA的试剂盒(Ambion)进一步纯化RNA,以污染基因组DNA。 按照制造商的说明,将RNA用作模板,用Superscript III逆转录酶和随机引物(Invitrogen)生成cDNA。 随后通过PCR进行cDNA扩增25个循环,每个循环包括在94°变性15s,在59°退火30s引物和在72°延伸1分钟。 使用Taq DNA聚合酶(Roche)和20 pmol基因特异性引物对200ng cDNA进行测定。引物序列如下:IAPF: 5′-ATGGGAGTGTCCACGGTTTCAG-3′IAPR:5′-CGATGCCAACAGACTTTCCTTG-3′,ALPF:5′-GAAGGTCGTACAACTGCTTATCC-3′,ALPR:5′-
GATTCCCACTGATTTGCCTGC-3′,EF1AF:5′-CGTCTGCCACTTCAGCATGTG-3′,EF1AR:5′ACTTGCAGGCGATGTGAGCAG-3′.
Assays were performed using a TProfessional thermocycler (Biometra).
SYBR-Green实时定量(q)RT-PCR分析
从8dpf的GF,CV或MO注射的幼虫中收获RNA,并如上所述产生cDNA。 在25μl反应中用对应于600 ng总RNA的cDNA和300nM基因特异性或对照引物进行qRT-PCR分析。 使用Primer Express 2.0软件(Applied Biosystems)设计基因特异性引物。Primer sequences are as follows; IAP151: 5′-GCCCTCACACTGCCTCTCA-3′, IAP233: 5′GAAACCGTGGACACTCCCATT-3′, TNF1F: 5′-TCCTCAGACCACGGAAAAGTG-3′,
TNF1R: 5′-CAACCCATTTCAGCGATTGTC-3′, TNF2F: 5′-
GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3′, TNF2R: 5′-
TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3′, EF1AF: 5′-
CGTCTGCCACTTCAGCATGTG-3′, EF1AR: 5′-ACTTGCAGGCGATGTGAGCAG-3′.
使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)一式三份进行测定。 将数据标准化至EF1A (ΔΔ Ct analysis, as described in the ABI User Bulletin #2, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).
组织学
除非另有说明,否则将斑马鱼幼虫在4%多聚甲醛中固定过夜,包埋在石蜡中,然后切成7μm厚的切片并将其安装在载玻片上。 样品在带有Nomarski和荧光光学镜的尼康TE2000倒置显微镜上成像。 使用CoolSNAP相机(Photometrics)或QImage Micropublisher相机(QImaging Corp)获得数字图像。 使用Metamorph收集并分析图像,并在Adobe Photoshop中进行处理。 对苏木精和曙红(H&E)染色的7μm横切面进行了与LPS治疗相关的组织病理学分析。
原位杂交--将5 dpf幼虫在4%PFA中静置过夜,并在1XPBST中洗涤。 将整个山体幼虫平衡到HYB +缓冲液中(Westerfield,1993),并在65°C下预杂交4h。 根据Boehringer的说明书(目录号1175025)制备RNA探针,并将HYB +中的100 ng RNA探针在65°C加热60分钟。 幼虫与RNA探针杂交36h。 通过将幼虫在2XSSC中的70%的50%甲酰胺中浸泡30分钟,然后在70°C的2XSSC的溶液中漂洗30分钟,并在70°C的0.2XSSC的溶液中漂洗2次,以除去探针。 根据标准方案(Westerfield,1993)检测探针,并如前所述将幼虫切成薄片进行成像。
髓过氧化物酶--将幼虫在4%PFA中静置过夜,并在1XPBS中洗涤。 用髓过氧化物酶试剂盒(Sigma)对整个幼虫进行染色,以对中性粒细胞进行组织化学鉴定。 Mpo活性已被用作斑马鱼嗜中性粒细胞的标志物,尽管在嗜酸性粒细胞和红细胞中也观察到弱染色(Lieschke等,2001),因此要注意不要过度显影Mpo染色。 染色后,将幼虫用0.1%Tween的1XPBS洗涤,包埋在石蜡中,将7μm的横切面固定在载玻片上。 定量分析肠上皮中Mpo染色强的细胞,该区域位于距肛门140微米的肛门连续20个连续切片中。