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肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
来源: | 作者:詹妮弗·M·贝茨1，Janie Akerlund，Erika Mittge，和Karen Guillemin | 发布时间: 2020-06-23 | 11209 次浏览 | 分享到:

Iap可防止LPS毒性
       我们假设内源性iap的作用是解毒肠上皮细胞遇到的lps。首先，我们通过将7只dpf幼虫暴露于250μg/ml lps（已用纯化的小牛肠道碱性磷酸酶（ciap）预处理）中，来测试去磷酸化lps是否与哺乳动物细胞一样具有较少的促炎性和较少的毒性（koyama等人，2002）。去磷酸化脂多糖未能诱导TNF或IAP的表达（图2D，数据未显示），对斑马鱼完全无毒，而相同剂量的模拟处理脂多糖在2小时内造成100%的致死率（图3A）。
       接下来，我们测试了Iap活性降低的斑马鱼对LPS的敏感性是否增加。通过将5个DPF幼虫浸泡在10毫米L-phen溶液中或注射IAP-mo抑制IAP，可显著提高对LPS的敏感性（图3B、C）。给6只dpf-wt幼虫注射30μg/ml lps，48小时内死亡率不高，而用10mml l-phen在4dpf下预处理，然后用lps在6dpf下暴露，48小时内死亡率为100%（图3b，logrank检验，p<0.0001）。单用左旋苯处理的对照幼虫在同一时期未显示出致死性（图3B）。在7dpf条件下，当暴露于150μg/ml lps时，经l-phen处理的幼虫也明显比wt幼虫更敏感（图3b，logrank，p<0.0001）。同样，注射iapmo的幼虫对lps处理更为敏感，在7dpf时给予150μg/ml剂量，死亡率约为90%，而对照动物的存活时间更长（图3c，logrank检验，p<0.0001）。最后，我们观察到降低iap活性的gf动物（见图1e）对150μg/ml lps的敏感性也增加（图3c，logrank检验，p<0.0001）。这些数据共同表明，内源性Iap可以针对生物学上相关范围的外源性LPS浓度提供保护。
微生物群调节肠道中性粒细胞的稳态数量
       我们接下来验证Iap是否在调节肠道对lps的炎症反应中起作用。我们发现在gf和cv 8-dpf幼虫之间，肿瘤坏死因子转录的水平没有变化，但这不足为奇，因为这些基因响应促炎性刺激（图2D）或菌血症激发而表达的瞬时特性（Pressley等， 2005年）。我们描述了肠道内中性粒细胞稳态对微生物群定植的响应。MPO被用作斑马鱼粒细胞或中性粒细胞的标记物，这些粒细胞或中性粒细胞已被证明渗透到与哺乳动物中性粒细胞相似的伤口部位（Bennett等人，2001；Lieschke等人，2001；Mathias等人，2006；Renshaw等人，2006）。与gf斑马鱼6dpf幼虫相比，cv的肠道中mpo转录水平升高（rawls等人，2004）。我们计数了幼虫肠道远端140μm的mpo阳性中性粒细胞，观察到这些细胞的优势分布。我们发现，在该器官的微生物定殖过程中，肠道中Mpo阳性中性粒细胞的平均数量增加，远端肠中平均2个中性粒细胞为6 dpf CV幼虫，到8 dpf时平均增加到平均7个中性粒细胞（图4Q ，R）。相比之下，GF肠在6和8 dpf时完全没有Mpo阳性中性粒细胞，表明中性粒细胞被吸收到肠道以响应微生物群（图4Q，R）。
       我们接下来研究了肠道中性粒细胞募集的机制。我们发现，150μg/ml lps暴露2小时后，mpo阳性的肠中性粒细胞显著增加（6 dpf中17个，8 dpf-cv幼虫中22个，图4d，e，q，r）。相比之下，暴露于150μg/ml经ciap处理的lps中2小时未能引起8只dpf幼虫中性粒细胞的任何增加（图4r）。根据我们的结果显示，myd88和tnfr1在其它lps反应中的重要性，我们测试了myd88 mo或tnfr1-mo是否能抑制肠道中性粒细胞的募集，我们发现myd88mo注射的幼虫在饲养cv时没有mpo阳性的肠道中性粒细胞，并且显著减少了lps的数量。这些细胞暴露于脂多糖（图4k，m，r）。同样，当饲养cv和暴露于lps时，注射tnfr1-mo的幼虫肠道上皮中缺乏mpo阳性中性粒细胞（图4l，n，r）。我们的研究结果表明，tlr和tnf信号在中性粒细胞流入肠道的过程中，对促炎性刺激以及由常驻微生物群建立的肠道中性粒细胞的稳态水平都起着作用。
Iap可防止对常驻微生物群的炎症反应
       接下来，我们检查了Iap在调节对微生物群的肠道炎症反应中的作用。在这些实验中，我们要么用iap-MO抑制6 dpf的Iap（当剪接阻断更有效时，数据未显示），要么用L-phen抑制8 dpf。我们发现，以6 dpf的剂量通过iap-MO注射的幼虫或以8 dpf的剂量进行L-phen处理的幼虫中Mpo阳性肠中性粒细胞的数量显着大于野生型对照，并且与暴露于LPS的幼虫中的数量相似（图4C ，F，O，Q，R）。接下来，我们测试了中性粒细胞的流入是否由与暴露于LPS或微生物群的野生动物相同的基于Myd88和Tnfr1的机制介导。在双倍注射了iap-和myd88-MOs（图4G，Q）或iap-和tnfr1-MOs（图4H，Q）的幼虫中，肠道Mpo阳性中性粒细胞数量大大减少（图4Q） Iap在Myd88和Tnfr1的上游起作用。最后，为了证明iap功能是必需的上游促炎化合物与常驻微生物群，我们检查了在没有微生物的情况下饲养的iap缺陷幼虫的中性粒细胞数量。当在生长因子条件下饲养时，iap-mo注射的6只dpf幼虫和l-phen处理的8只dpf幼虫的肠上皮中mpo阳性中性粒细胞数量非常低（图4h，p，q，r）。野生型gf肠道能够募集中性粒细胞，这一点可以从这些动物对lps暴露的强烈中性粒细胞流入中得到证明（图4r）。这些结果表明，gf-iap缺乏的幼虫缺乏肠道中性粒细胞，因为它们缺乏iap的促炎症基质，这与内源性iap对肠道细菌相关lps的解毒作用是一致的。
探讨
       利用GF斑马鱼模型，我们发现LPS在肠道细菌定植期间诱导Iap活性（bates等人，2006）。哺乳动物Iap是肠上皮细胞分化的标志物，但其内源性底物尚不清楚。Iap能够使许多不同的LPS血清型脱磷（tuin等人，2006），这是一种产生无毒分子形式的反应。我们测试了一种假设，即斑马鱼的Iap可以解毒与肠道细菌相关的LPS。
       已知lps及其信号传导的下游产物对哺乳动物有毒性，但此前这种反应还未在斑马鱼中被发现过。我们报道了LPS治疗斑马鱼导致剂量依赖性死亡、器官衰竭、肝细胞肿胀和中性粒细胞浸润等特征性组织病理学改变以及炎性细胞因子、tnfa和tnfb的动态转录诱导。斑马鱼和小鼠间的LPS致死剂量是很难比较的，因为我们使用了水源给药途径，这会导致LPS摄入以及皮肤和鳃的暴露。在8dpf斑马鱼幼体肠道内，我们估计大约有4×105个细菌，其中大部分为革兰氏阴性，在大约1至4nl的体积内，导致大约1011/ml的细菌浓度，类似于人类结肠的细菌浓度（savage，1977）。根据沙门氏菌的总内毒素和脱落内毒素的测量（Freudenberg等人，1991年），该细菌密度将斑马鱼肠道中总内毒素的浓度定为mg/ml，脱落内毒素的浓度定为几十μg/ml，在本研究使用的浓度范围内。在败血性休克的小鼠模型中，LPS通常以约50 mg / kg体重的剂量腹膜内给药以达到100％的致死率，并且口服时毒性降低约10倍（Youngner，1972）。我们表明，在斑马鱼中，与在哺乳动物中一样，通过抑制Myd88和Tnfr可以改善LPS的毒性。此外，用纯化的CIAP预处理LPS使其对斑马鱼完全无毒。最后，我们证明了通过药理作用或基因特异性MO抑制内源性Iap会导致对LPS毒性超敏反应。