Evgeniya E. Burkova 1, Alina E. Grigor’eva 1, Dmitrii V. Bulgakov 2, Pavel S. Dmitrenok 3, Valentin V. Vlassov 1, Elena I. Ryabchikova 1 , Sergey E. Sedykh 1,†
and Georgy A. Nevinsky 1,*,†

1 SB RAS Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, 8 Lavrentiev Ave.,
630090 Novosibirsk, Russia; jorochka24@mail.ru (E.E.B.), feabelit@mail.ru (A.E.G.); valentin.vlassov@niboch.nsc.ru (V.V.V.); lenryab@yandex.ru (E.I.R.); sirozha@gmail.com (S.E.S.)


2 Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, 690022 Vladivostok, Russia; bulgakov-dv@mail.ru


3 G. B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS, 159 100 let Vladivostoku Ave.,
690022 Vladivostok, Russia; paveldmt@piboc.dvo.ru

* Correspondence: nevinsky@niboch.nsc.ru; Tel.: +7-383-363-51-26

† These authors contributed equally to this work.

摘要：外泌体是一种包含多钟RNA和不同蛋白质的纳米囊泡（30-100 nm）。其在细胞内通讯，免疫功能等方面很重要。不同来源（包括胎盘）的外泌体主要通过不同类型的离心和超速离心获得，据报道其中包含数十种至数千种不同的蛋白质。首先使用几次标准离心从四个胎盘（正常妊娠）中获得的外泌体制剂，然后再通过Sepharose 4B的凝胶过滤将其纯化。单个制剂会显示出不同的凝胶过滤曲线，展现出外来峰与杂质蛋白及其复合物的两个峰之间的好坏之分。通过电子显微镜观察到，凝胶过滤前的外泌体包含不同大小的囊泡，由铁蛋白形成的环状结构以及聚集的蛋白质及其复合物簇。通过220 nm滤膜和凝胶过滤后，外泌体通常显示出其外泌体的形态和大小（30–100 nm），并且不含可见的蛋白质混合物。蛋白质的胰蛋白酶解产物通过SDS-PAGE和2D电泳后，通过MS和MS / MS MALDI质谱进行外泌体蛋白质的鉴定，我们获得了意想不到的结果。优质的纯化外泌体仅包含11-13种不同的蛋白质：CD9，CD81，CD-63，血红蛋白亚基，白介素-1受体，膜联蛋白A1，膜联蛋白A2，膜联蛋白A5，胞质肌动蛋白，碱性磷酸酶，血清转移蛋白，以及可能是人血清白蛋白和免疫球蛋白。我们假设以前使用粗制制剂发现的可能的外泌体蛋白数量可能被过度高估了。我们的数据可能对研究纯外泌体的生物学功能很重要。

关键词：人体胎盘；外泌体提纯；蛋白质分离；蛋白质鉴定

1. 引入

       人胎盘是连接母体和胎儿生物体的高度特定化的器官，胎盘功能障碍可能对两者都会带来灾难性后果。 胎盘的绒毛与合体滋养层细胞接壤，形成了分隔母婴血液循环的血胎盘屏障^[1]。 胎盘可保护、滋养和调节胚胎的生长^[2-4]。 妊娠和胎盘功能研究的进展可能有助于移植法的发展； 但这也需要对母亲和胎儿的生化特征进行详细研究。

       外泌体是直径为30–100 纳米的囊泡，具有独特的分子组成，能够实现许多功能，包括细胞间通信^[5,6]。 细胞之间的信号传递对于母胎系统尤为重要，在该系统中胎盘是提供两种生物之间相互作用并保持其个性的器官^[1,2,4]。 胎儿和母亲之间的分子信号传递仍然是模糊的，并且尚未发现外泌体在此过程中的可能作用。

       已知外泌体是通过向晚期内体的膜内陷形成的，这些内体在体内积累，随后从细胞中释放出来^[5,6]。 根据现代分类，外泌体属于细胞外囊泡的类别，其还包括微囊泡和凋亡小体。 外泌体是从人类和哺乳动物的各种生物体液中分离出来的，包括牛奶^[1,5-14]。

       胎盘外泌体及其分子组成研究的相关性取决于胎盘中是否存在多种因素，包括生物活性RNA、DNA、蛋白质、肽、抗体和其他成分^[1-4]。

       外泌体研究的进行是通过使用多种方法从生物体液中分离出来制剂，其中包括离心沉淀、超速离心以及密度梯度超速离心^[15-27]； 通过孔径为0.1–0.2μm的过滤器和其他方法进行超滤^[25–29]。 应当注意的是，所有这些方法可以获得富含外泌体的制剂，而不是均质的纯外泌体制剂，因此会影响外泌体的分子组成。 实际上，每种外泌体分离的方法可能导致数据的高度可变，并且在不同出版物中，在外泌体中鉴定出的蛋白质数量变化范围甚至达数百倍^[15-29]。

       对78个已公开的外泌体数据库进行的萃取分析显示，从正常和癌细胞的培养液以及各种物种（包括人，小鼠，大鼠， 牛，苍蝇，酵母，甚至细菌^[13]。 胎盘外泌体蛋白质组成的数据很少，在不同的研究中差异很大。 根据蛋白质分析方法的不同，在胎盘外泌体制剂中发现了数百甚至数千种蛋白质：349 ^[30]和1476蛋白^[31]。

       在人类合体滋养层微囊泡的蛋白质组学分析中，鉴定出超过400多种蛋白质^[32]。 与健康孕妇相比，子痫前期中发现25种蛋白质（整合素，膜联蛋白和组蛋白）的表达差异。根据研究结果[1]科研假设可能存在来自不同来源的外泌体的一般和特定标记。

       根据文献资料显示，不同来源的外泌体可能包含不同量的蛋白质。例如，树突状细胞外泌体的粗制品可以包含150-200多种不同的蛋白质^[32-34]。 分析奶牛乳汁外泌体的蛋白质时，通过蔗糖梯度中的离心和超速离心分离^[35] 甚至获得了更不可能的结果。最终是鉴定出2107种蛋白质，其中包括先前检测到的外泌体的所有主要蛋白质标记。牛乳外泌体蛋白中最代表的蛋白是乳脂球的膜蛋白：酪氨酸，黄嘌呤氧化酶，己二酸和乳糖苷^[36]。