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肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
来源: | 作者:詹妮弗·M·贝茨1，Janie Akerlund，Erika Mittge，和Karen Guillemin | 发布时间: 2020-06-23 | 11207 次浏览 | 分享到:

       为了测试这种酶在预防炎症反应中对微生物群的作用，我们研究了中性粒细胞进入肠道的调节。我们发现肠道上皮中Mpo阳性中性粒细胞的稳态数量是由微生物群建立的，而GF幼虫缺乏所有这些细胞。我们没有发现 巨噬细胞参与肠道微生物或外源性脂多糖的炎症反应的证据。从GF、CV和LPS暴露的鱼的解剖内脏中分离的RNA显示出Mpo水平与肠道中性粒细胞数量相关的显著差异，而我们观察到这些样本之间巨噬细胞特异性基因、集落刺激因子1受体的转录水平没有差异（未发表的结果）。我们证明，在微生物群定植时建立肠道免疫细胞内稳态使用相同的蛋白质，myd88和tnfr1，它们促进肠道炎症对外源性lps的反应。这些结果表明先天免疫信号在黏膜免疫成熟中的重要性，类似于在myd88缺陷小鼠的肠道相关淋巴组织中观察到的细微发育缺陷（iiyama等人，2003）。在小鼠中，已证明myd88功能仅在髓细胞而不是肠上皮细胞中被要求用于对肠损伤的微生物依赖性反应（Pull等人，2005）。确定斑马鱼肠中myd88功能的细胞分布和需求将是一个有趣的课题。
       微生物群通过与内毒素类似的机制引发肠道炎症的能力，突出了宿主策略的重要性，即选择合适的微生物群落（在某些炎症性肠病中可能会出错的过程（Eckburg和Relman，2007））和限制该群落的炎症影响。事实上，抑制先天性免疫反应（如myd88介导的免疫反应）可能改变肠道微生物群落，从而间接导致肠道炎症的减少。然而，当我们将注射MYD88MO的微生物群和在同一水中一起饲养的对照幼虫培养时，我们观察到两组之间的细菌负荷或菌落形态没有显著差异（未公布的结果），这与微生物群的变化是导致MPO阳性中性粒细胞在小鼠体内缺失的原因相矛盾。
       通过描述在有无微生物条件下Iap缺陷饲养鱼的中性粒细胞浸润，我们发现Iap作用于与微生物群相关的促炎信号上游。总之，我们的结果表明，在定植过程中被微生物群上调的Iap具有解毒微生物群相关lps的功能，从而建立一个稳态负反馈回路，防止tlr和tnf信号过量和肠道炎症（图5）。因此，Iap在限制常驻肠道微生物的促炎症潜能和促进粘膜对占斑马鱼微生物群很大比例的革兰氏阴性菌的耐受性方面发挥着重要作用（bates等人，2006；rawls等人，2006）。
       重要的是，iap酶活性高度局限于顶部肠上皮（bates等人，2006），因此其lps解毒活性预计不会影响宿主对穿透肠上皮屏障的革兰氏阴性病原体的检测。除了刷状边界定位外，哺乳动物的iap也被证明是由肠细胞分泌的（alpers等人，1995），这增加了这种酶可能具有肠外活性的可能性，正如研究表明，在大鼠静脉注射纯化的小牛iap，然后注射lps后，肝细胞减少。与单纯注射脂多糖的对照大鼠相比的损伤（Tuin等人，2006年）。正如免疫系统在不同组织中的精细化一样，微生物产品的局部修饰可能代表微生物-宿主相互作用的一个未被充分认识的方面。宿主脂多糖毒性酰氧基水解酶（AOAH）在肾皮质的局部表达和分泌到尿液中可能有助于保护尿路免受革兰氏阴性菌的过度炎症反应（Munford，2005）。值得注意的是，在鱼类基因组中没有发现aoah同系物（munford和varley，2006），这表明其他lps解毒机制，如涉及aps的机制，可能在这些物种中发挥更重要的作用。在肺上皮细胞中表达的另一种宿主酶，哺乳动物乳糖酶，对氧磷酶-2（pon2），已被证明可降解细菌群体感应高丝氨酸内酯自诱导物，并干扰铜绿假单胞菌气管感染所需的信号机制（stoltz等人，2007）。在这里，我们已经证明Iap是另一种大量的宿主酶，用于修饰特定组织遇到的细菌信号。目前正在进行实验，以验证Iap在防止哺乳动物对微生物群的炎症反应方面的功能是否是保守的。
       人类对脂多糖表现出广泛的反应。这种表型多样性的可能机制包括人类群体中TLR4基因的广泛多态性，对脂多糖反应较弱的TLR4等位基因与更高的肠道细菌感染发病率相关，但与慢性炎症相关的疾病风险降低（Miller等人，2005）。在哺乳动物AP基因中也存在相当程度的遗传多样性（MARAMAN），AKP2等位基因变体，编码TNAP，已被证明在小鼠中调节血清AP活性（Furman等），提示IAP基因的变化有助于LPS应答的可能性。iap活性的发育变异也可能对人类健康产生重要影响。例如，由于缺乏IAP活性，患坏死性小肠结肠炎的婴儿的早产儿可能会出现严重的炎症反应。
       细菌-动物共生的特点是合作伙伴之间仔细协商，以优化其共享环境。互惠信号存在于这些相互作用中，微生物信号调节宿主过程，然后直接或间接影响微生物群的组成或活动。微生物肠道菌群已经被证明可以通过抑制k途径中的多个步骤来主动抑制炎症（Ismail和Hooper，2005），这里我们展示了斑马鱼中许多肠道菌群共有的一个信号，lps，上调iap，其功能是防止过度的肠道炎症，这一反应将有害于微生物群和宿主相似。
实验步骤
无菌斑马鱼养殖
       所有实验的斑马鱼均遵循俄勒冈大学动物护理机构和使用委员会批准的实验方案并符合标准实验方案（Westerfield，1993）。如前所述（Bates等，2006），产生了CV，GF和与单缔合的幼虫，并评估了GF胚胎的无菌性。为了得到注射GF Iap-MO的动物，按照标准程序（Westerfield，1993），通过体外受精产生了胚胎，除了使用先前所述的抗生素胚胎培养基（Bates等，2006）使卵受精，然后如下所述注射iap-MO。然后按照先前的描述（Bates et al。，2006）将注射的胚胎衍生为GF，不同的是将0.003％的次氯酸钠浸泡的时间从30分钟减少到20分钟，另外将胚胎浸泡在0.1％的聚乙烯基吡咯烷酮碘2分钟。用于单分子生物学的细菌是斑马鱼分离株veronii veronii biovar sobria，荧光假单胞菌（Bates等，2006），链球菌和葡萄球菌菌株（未发表数据）以及从小鼠分离出的链球菌，它们定居在斑马鱼上（Rawls等，2006 ）。通过将细菌培养物注射到GF 5 dpf幼虫的烧瓶中以达到106个菌落形成单位（CFU）/ ml的最终浓度来产生单关联动物，该细菌在8 dpf幼虫中的最终细菌载量与8 dpf CV幼虫相当（（Bates等，2006）和未发表的数据）。
脂多糖和L-苯丙氨酸治疗
       除非另有说明，通常情况下将经过LPS过滤器灭菌的溶液在7dpf（大肠杆菌血清型0111：B4，Fluka）注入GF和CV幼虫的最终浓度为3–250μg/ ml的烧瓶中。值得注意的是，从sigma购买的LPS产生了不同程度的结果，而从fluka购买的4个不同批次的lps给出了可重复的结果。商业来源的脂多糖含有微量的肽聚糖（pgn）和脂蛋白污染物（Hirschfeld等人，2000年）。为了测试lps是否是由pgn污染引起的，我们将7条dpf斑马鱼幼鱼暴露于高达1 mg/ml的纯化pgn（金黄色葡萄球菌77140，fluka）溶液中，但在24小时内没有观察到杀灭作用。为了测试lps毒性是否由脂蛋白污染物引起，我们将7条dpf斑马鱼暴露于合成脂肽pamcys ser-（lys），（alx-165-066，axxora）的溶液中，这种合成脂肽是已知的免疫佐剂（erhard等人，2000），高达500μg/ml，并且在24小时内也没有观察到这些处理的杀灭作用。为了产生去磷酸化的脂多糖，将脂多糖与从牛肠粘膜（alpi12g，biozyme实验室）纯化的0.148u/μl ciap在37℃孵育4h，然后在80℃孵育10min以破坏ciap活性。模拟处理过的lps是在相同条件下孵育而不添加ciap的lps。为了抑制iap，除非另有说明，否则在试验期间，幼虫在10 mm l-phen溶液中孵育，从5 dpf开始。在l-phen处理的仔鱼中观察到一些残余iap活性，但是较高剂量的化合物不易溶解，似乎对鱼有毒。