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人类胎盘的超纯外泌体含少量几种的主要蛋白质
来源: | 作者:Evgeniya E. Burkova 1, Alina E. Grigor’eva 1, Dmitrii V. Bulgakov 2, Pavel S. Dmitrenok 3, Valentin V. Vlassov 1, Elena I. Ryabchikova 1 , Sergey E. Sedykh 1,†
and Georgy A. Nevinsky | 发布时间: 2020-06-23 | 11173 次浏览 | 分享到:

10-14 nm）（图A插图）。标尺线的长度为100 nm。

图3.透射电子显微镜，负对比度。 通过具有100 nm孔的过滤器过滤后进行胎盘外泌体的制备，然            后进行凝胶过滤（A，B）。 囊泡（A）和铁蛋白环结构（10-14 nm；插图A中的插图）不存在可见        的蛋白质簇。 通过凝胶过滤纯化的外泌体，用金纳米颗粒与针对四跨膜蛋白CD81（C，D和E）和对CD63（F，G和H）的单克隆抗体的缀合物标记。标尺线的长度为100 nm。

     

      

     图4.经过超速离心和凝胶过滤两个阶段后的外泌体制剂的流式细胞仪。图中显示了含有CD9（插图的左列）和CD81（插图的右列）的囊泡的相对量。 所有名称均在面板（A–J）中给出。

    使用SDS-PAGE，我们分析了通过凝胶过滤获得的有三个峰的蛋白质。图5B显示了对应于第一个外泌体制剂的exo-1的SDS-PAGE的典型结果。外泌体的波峰与蛋白质杂质的第二个和第三个波峰完全分开。电子显微镜检查显示，在凝胶过滤之前和之后，外泌体制剂中铁蛋白（10-14 nm）会形成环超分子结构（图3A）。根据凝胶过滤前SDS-PAGE的结果，铁蛋白的轻链和重链是exo-1（图5C）和其他三种制剂的主要蛋白质。

       在没有二硫苏糖醇（DTT）的情况下，一部分铁蛋白对应于MMs〜23–25 kDa，其寡聚形式为〜180 kDa的单体以及凝胶中未包含的铁蛋白-蛋白质复合物（图5C，道– DTT；凝胶过滤之前）。用DTT处理exo-1会导致寡聚形式部分遭受破坏，并使对应于铁蛋白轻链带中的蛋白质增加（图5C，+ DTT）。用DTT处理外泌体制剂之前的峰2和3主要包含寡聚形式的铁蛋白（图5C，-DTT）。用DTT处理后，exo-1含有较少的铁蛋白寡聚形式（图5C，+ DTT）。凝胶过滤导致exo-1制剂中铁蛋白几乎完全消失（图5B，-DTT）。通过凝胶过滤前后三种其他外泌体制剂获得了类似的结果。

       图5.使用Nanosight NS300设备在制备凝胶过滤后对外泌体大小进行纳米颗粒追踪分析（A）。通   过过滤0.1μm，但在FPLC凝胶过滤（B；两个第一泳道：–DTT和+ DTT）过滤后，通过过滤后的   exosome制剂exo-1的内在蛋白质的SDS-PAGE分析 （B；两个第二车道：–DTT和+ DTT）。对 exo-1制剂（C；–DTT和+ DTT泳道）进行凝胶过滤后，分析对应于峰2和峰3（图1A）的杂质         蛋白质。泳道C对应于具有已知MM（B和C）的对照蛋白。使用MALDI质量MS和对应于SDS-PA

         后蛋白质条带的蛋白质水解产物的MS / MS数据进行蛋白质鉴定；鉴定的蛋白质列在B和C中。

       exo-2制剂的凝胶过滤稍弱的分离了外泌体的峰与离心过程中共沉淀的蛋白质峰（图1B），并且所得外泌体的制剂即使在对应于第一个峰的第一个峰处也含有许多不同形式的铁蛋白外泌体。

       在通过凝胶过滤分离出exo-1第一峰蛋白质的一维SDS-PAGE后，使用MALDI质谱法鉴定了八种主要蛋白质，胰蛋白酶蛋白水解物的MS / MS对应于蛋白质谱带：血红蛋白，铁蛋白（单体）和低聚物），CD63，CD81，碱性磷酸酶，人血清白蛋白（HSA），α-肌动蛋白4和IgG（图5B，-DTT，峰1，表1）。

       在对exo-2的第一个峰进行类似的SDS-PAGE后，鉴定出11种蛋白：铁蛋白（单体和寡聚物），血红蛋白，CD81，CD63，膜联蛋白，细胞质肌动蛋白，碱性磷酸酶，HSA，血清转铁蛋白，α-肌动蛋白-4和 IgG。

       针对exo-3，仅鉴定出11种蛋白质（表1）； 它另外包含两个膜联蛋白：膜联蛋白5和膜联蛋白2（图6A）。 有趣的是，在exo-3的情况下，铁蛋白几乎不存在（图6A，磁道1）。 因此，通过电子显微镜在外泌体制剂中鉴定出的环状铁蛋白超分子结构（图3），原则上可以通过凝胶过滤去除，因此应视为在不同离心过程中与外泌体共沉淀的蛋白质。

         表1.通过MS和MS / MS方法鉴定的蛋白质的数据，这些蛋白质对应于exo-1（图    5B）和exo-3   （图6A）的凝胶过滤后的第一个峰，以及随后通过SDS-PAGE分离的峰。

       紧接着，我们分析了使用2D电泳通过exo-3制剂的凝胶过滤获得的第一个峰的蛋白质（图1C），并鉴定了28个染色斑点（图6B），仅对应于9种不同的蛋白质及其同工型（表2）。有趣的是，只有一个斑点对应于血红蛋白和膜联蛋白A1的亚基。其余斑点对应于蛋白质的不同同工型（蛋白质斑点数量）：膜联蛋白A2（4），膜联蛋白A5（3），胞质肌动蛋白（7），碱性磷酸酶（5），HSA（2）和血清转铁蛋白（2）。确定了三个蛋白斑点为免疫球蛋白的轻链和重链（表2）。因此，二维电泳只能鉴定9种蛋白质。同时，只有在一维电泳后才能鉴定出三种次要蛋白质CD81，CD63和alpha-actin-4；二维电泳可用于另外鉴定膜联蛋白A1（表2）。

       通过SDS-PAGE分析exo-4第一个峰的蛋白质时，鉴定出11种蛋白质：铁蛋白，血红蛋白，CD81，CD63，膜联蛋白2，膜联蛋白5，胞质肌动蛋白，碱性磷酸酶，HSA，α-肌动蛋白4和IgG。

       因此，外泌体的四个样本包含几种常见的蛋白质（鉴定出该蛋白质的制剂数量）：铁蛋白（3），血红蛋白（4），CD81（4），CD63（4），各种膜联蛋白（4），胞质肌动蛋白（