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肠道碱性磷酸酶解毒脂多糖并预防炎症在肠道微生物群的响应
来源: | 作者:詹妮弗·M·贝茨1，Janie Akerlund，Erika Mittge，和Karen Guillemin | 发布时间: 2020-06-23 | 11138 次浏览 | 分享到:

       接下来，我们通过用特定于该基因的剪接阻断MO来阻断该基因的表达来测试该基因是否编码了斑马鱼肠中的AP活性（图S1A）。当饲养到8 dpf时，与野生型（WT）肠相比，注射iap-MO的动物的肠表现出显着降低的AP活性（图1D）。 Iap-MO特异地抑制了肠道中AP的活性，并且没有改变缺乏肠道的cas体中的AP活性（图1D）。我们观察到从5 dpf浸入10mM L-苯丙氨酸（L-phen）（一种IAP同工酶的特异性抑制剂）的溶液中，对8 dpf的鱼具有类似的肠道特异性抑制活性（Fishman等，1963）（图1D）。用抗α，3半乳糖基转移酶（galT）基因的对照MO处理不会改变Iap活性（图1E）。根据这些结果，我们将22号染色体ap基因指定为斑马鱼肠道碱性磷酸酶（iap）。来自注射iap-MO的动物的肠道保留了一些AP活性，这可能是由于在这些动物中存在一些WT iap转录物表明，在8 dpf时iap-MO的抑制作用不完全（图S1A）。此外，由于iap-MO对5 dpf肠的总AP活性没有抑制作用，但对8 dpf肠的AP活性却降低了，因此肠道中的某些AP活性很可能是由无处不在的alp基因编码的（图S1B ），尽管在更早的时间点可以更有效地阻止IAP转录剪接（数据未显示）。
细菌脂多糖对斑马鱼Iap转录的调节
       我们以前曾报道过，纯化的LPS浓度为3μg/ ml，足以在GF幼虫中诱导Iap活性达到CV对照水平（Bates等，2006）。在这里，我们测试了Iap活性是否可以被其他LPS进一步诱导。我们观察到，暴露于30μg/ ml LPS的CV幼虫的Iap活性显着高于未处理水平（图1E）。如我们先前所示，GF幼虫与来自斑马鱼肠的革兰氏阴性细菌分离株（气单胞菌和假单胞菌属）单缔合足以诱导Iap活性达到CV水平，但是当我们将GF幼虫与数个革兰氏单亲结合时阳性分离株（链球菌和葡萄球菌）在其细胞壁上缺乏LPS，我们没有观察到Iap活性的诱导（图1E和数据未显示）。这些结果表明，LPS足以在斑马鱼中诱导Iap活性。
       为了了解Iap诱导的机制，我们检查了CV和GF幼虫中Iap转录本的程度。半定量RT-PCR显 示，暴露于50μg/ ml LPS 24h后，肠道中的iap转录水平增加，而在整个处理过程中，整个生 物体中alp的转录均保持不变（图1C）。使用定量逆转录PCR（qRT-PCR），我们发现，类 似于Iap酶活性的调节，在细菌存在下，iap转录水平显着提高（图1F）。此外，暴露于外源LPS（30μg/ ml，持续24小时）足以增加GF幼虫的Iap转录水平，并使Iap高于CV幼虫的 正常水平（图1F）。
细菌对Iap活性的调节依赖于Myd88
       响应LPS的Iap的诱导表示该基因受Tlr信号传导调控的可能性。在斑马鱼基因组中已经鉴定出几种Tlr4直向同源物和一个编码Myd88的单一基因（Jault等，2004； Meijer等，2004）。为了测试Myd88对于LPS诱导Iap是否重要，我们使用了剪接阻断MO来斑马鱼myd88（图S1C）。注入myd88-MO的鱼没有表现出明显的形态缺陷（数据未显示），与斑马鱼用不同的myd88-MO（van der Sar等，2006）和Myd88-/-小鼠（Iiyama等， 2003）。为了测试Myd88是否需要Iap活性的幼虫上调，我们从myd88-MO注射的幼虫中解剖了肠，并分析了组织的AP活性。尽管在5 dpf时CV或GF WT动物之间，myd88-MO注射动物肠道的AP活性是无法区分的，但在肠道细菌定殖开始时，myd88-MO注射幼虫的肠道AP活性却没有增加8 dpf，与GF WT动物相似（图1E），表明CV动物中Iap的微生物群依赖性诱导是Myd88依赖性的。接下来，我们调查了Myap88依赖方式是否通过外源LPS调节了Iap转录本的程度。使用qRT-PCR，我们发现用myd88-MO注射的幼虫用50μg/ ml纯化的LPS处理24小时无法增加IAP（图1F），表明Myd88是LPS介导的IAP诱导所必需的。
脂多糖对斑马鱼的致毒
       摄入或腹腔注射高剂量的脂多糖对哺乳动物是有毒的（van Amersfoort等人，2003）。脊椎动物对脂多糖毒性表现出广泛的敏感性：与大鼠和小鼠相比，小牛非常敏感，而鱼和青蛙更具抵抗力（Berczi等人，1966年）。我们发现，将6 dpf斑马鱼幼虫浸泡在含有高浓度LPS的水中会导致死率、存活率和杀灭动力学与LPS剂量成正比。5dpf的幼虫对lps的杀灭更有抵抗力，这可能是由于tlr信号通路基因的表达减少，在某些情况下，tlr信号通路基因的表达具有动态的发育表达谱（jault等人，2004）。在6dpf时，30μg/ml lps剂量不能致死，50μg/ml剂量在48小时能达到 100%死亡率，150μg/ml剂量在4.5小时达到 100%死亡率，250μg/ml剂量导致2小时内100%幼虫死亡（图2a）。与哺乳动物相似，暴露于脂多糖的斑马鱼也表现出器官衰竭，表现为心跳和嗜睡减少，以及水肿和血池，这可能是严重心动过缓的结果（数据未显示）。
       Lps毒性在哺乳动物中具有典型的组织病理学特征，包括肝脏、心脏和肠道的损伤，以及受感染的水肿和中性粒细胞浸润。对斑马鱼幼鱼暴露于100μg/ml脂多糖24小时并在死亡前处死的肝脏进行组织学分析，发现肝细胞肿胀、紊乱（图2c）和髓过氧化物酶（MPO）阳性中性粒细胞浸润（图2f），与脂多糖致敏小鼠的病理报告相似（Inoue等人，2005）。与lps中毒的哺乳动物一样，我们还观察到mpo阳性中性粒细胞在lps处理的幼虫体内的肠道浸润，如下所述。
       LPS毒性在哺乳动物中的一个特征是诱导高水平的促炎性细胞因子Tnf转录。用50μg/ ml LPS处理的7 dpf幼虫的qRT-PCR分析显示了两种斑马鱼tnf直向同源物的显着瞬时诱导，在暴露后4h诱导达到较高水平，到8h后显着下降（图2D）。在LPS诱导的大鼠菌血症模型（Xuan等，2001）和斑马鱼胚胎中，革兰氏阴性鱼病原菌爱德华氏菌感染的菌血症模型中观察到了类似的瞬时Tnf诱导（Pressley等，2005）。
       LPS毒性在哺乳动物中的另一个特征是TLR和TNF信号的参与。我们发现，注入myd88-MO的幼虫在LPS暴露后表达的tnf转录物水平较低（图2D）。此外，在两种不同的LPS浓度下，myd88-MO注射的幼虫对LPS杀灭的抵抗力明显更高（图2G，Logrank测试，P <0.0001）。为了测试Tnfr在对LPS响应中的可能作用，我们使用了对斑马鱼tnfr1进行剪接阻断的MO（图S1D）。在两种不同的LPS浓度下，注射tnfr1-MO的鱼类对LPS的抵抗力也比野生型鱼类明显更高（图2H，Logrank测试，P <0.0001）。注射myd88-和tnfr1-MO的幼虫均服从LPS治疗，尽管动力学较慢，这可能分别是由于Myd88和Tnfr对LPS毒性的独立机制以及MOs不完全抑制所致（图S1C，D）。